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首贴:     • 亚克隆技术过程-通用生物系统 (849字, 点击: 30) millymiao 2020-08-18 06:11:36

亚克隆技术是指在获得它们的情况下基因的DNA片段的再克隆,以进一步分析或重组靶基因的DNA。亚克隆技术也是分子克隆技术。

这项技术的出现使人们可以对基因DNA序列进行更深入的研究,阐明基因的功能,并从遗传学角度分析生物的表型。


亚克隆的技术过程主要分为四个步骤:获得目标片段,将消化的载体与目标片段连接,转移到宿主细胞中,进行鉴定和筛选。

获得目标片段的方法
直接从基因库中获得目标基因片段;

采用PCR技术,以mRNA为模板逆转录cDNA序列,获得cDNA文库,获得目的基因;

使用限制酶将供体DNA切割成许多片段,并将其引入细胞。筛选后,获得含有靶基因的细胞;

获得基因序列信息,并在体外进行人工合成。


连接限制性酶切载体和目标片段
选择适当的限制性核酸内切酶以切割载体的靶片段序列。通常情况下,会出现三种情况:对称粘端,非对称粘端和钝端。在亚克隆实验中,不对称粘性末端连接是优选的,它可以将外源DNA导入载体。

转移到宿主细胞
通常有两种方法将与靶基因相连的载体转移到细胞中:转化/转染和转导。

转化/转染是将重组质粒或噬菌体转移至处理过的宿主细胞中;转导的方法是用携带外源DNA的病毒感染宿主细胞。通常,转导比转化方法更有效。


鉴定筛选
克隆细胞的筛选通常使用直接筛选。该载体具有可识别的遗传标记,可以有效地将重组分子与原始细胞区分开。

一些载体分子携带外源基因后,形成的菌落或斑块的颜色具有明显的变化,例如从蓝色变为无色,并且明显的颜色表型变化可以清楚地区分重组分子。

此外,还有其他一些药物筛选方法可以通过表型现象有效筛选克隆的细胞。



Generalbiosystems 拥有经验丰富的技术团队和获得专利的基因合成平台,可以为客户提供一站式的亚克隆服务,包括靶基因合成,载体构建和转化,鉴定和筛选。

在亚克隆服务中,将交付4μg干粉质粒DNA,含有质粒的甘油细菌或穿刺细菌,测序结果(ab1格式)和通过QC检查的酶消化验证文件。Generalbiosystems将为客户提供准确,快速的亚克隆服务。

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